上转发光技术及其在食品中病原微生物检测的应用

□ 林长青 北京热景生物技术有限公司

近年来，由食源性致病菌引发的食物中毒不断发生，1996年日本发生了世界上规模的历时3个月、波及40多个都府县、涉及上万人的大肠杆菌O157食物中毒事件；2001年因发生“疯牛病”导致德国卫生部部长和农业部部长辞职；2005年遍及整个东南亚的禽流感更为各国的食品安全部门敲响警钟；2011美国23个州爆发了活禽引发的沙门氏菌疫情，造成将近100人感染；我国也爆发过多起由食源性致病菌引起的食物中毒事件，其中1999年爆发的大肠杆菌O157:H7中毒事件，中毒人数达2万，其中死亡177人，给我国经济造成了巨大损失。

食品安全已成为世界各国共同面临和关注的问题，由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最主要的因素之一。快速而准确地检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务，因此建立一种快速、准确、便捷的检测技术，对于从源头制止食源性致病菌污染，预防中毒事件的发生具有重要意义。食源性致病菌的传统检测方法主要有微生物培养法、电阻电导测定法、细菌直接计数法、分子生物学法、免疫学方法等。但传统微生物检验方法，不仅步骤复杂，而且耗时费力、灵敏度也不高，难以吸水纸上，拍干；

g.立即在每孔中加入底物混合液，盖好盖板膜，轻轻振荡混匀，室温下避光反应；

h.揭开盖板膜，在每孔中加入终止液，轻轻振荡混匀；

i.终止后5min内用酶标仪取吸光度值。

该试剂盒灵敏度0.04ppb,原奶样本检测限为0.1ppb,奶粉检测限为0.5ppb,样品回收率范围90%±30%.

黄曲霉毒素M1快速检测试纸条

试纸条将特异性的抗原以条带状固定在膜上，金标抗体吸附在微孔中，待检样本溶解微孔的金标抗体后通过毛细作用向前移动至固定抗原区域时，待检物与金标抗体的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。

设备：温育器；微量移液器。

检测步骤：

a.将待检奶样和产品组分恢复至室温；

b.打开铝箔袋，取所需量金标微孔和试纸条；

c.待检奶样充分摇匀后加入金标微孔中，置于50℃温育器中温育；

d.将试纸条插入金标微孔中反应；

e.从金标微孔中取出试纸条，去试纸条下端的样品垫，判定结果。

结果判定：

阴性：T线比C线颜色深或者一致，检测结果为阴性。

阳性：T线比C线颜色浅或者没有颜色，检测结果为阳性。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸条均判为无效。

该试纸条对原奶和奶粉检测限均为0.2ppb.

黄曲霉毒素M1胶体金检测试纸条具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、经济、稳定性好等优点。可以满足大量试样筛选的需要，可以在小型和现场实验室进行，在商检、卫检等基层容易普及。

适应飞速发展的现代食品生产要求。上转发光技术是一种新的检测方法，具有简便、快速、廉价、适应性广等优点，可用于基层单位中各种食源致病菌的快速筛查检测。

食品中病原微生物快速检测

技术常用方法及其优缺点

食品微生物快速检验方法的研究始于上世纪80年代早期，随着食源性疾病发病人数显着增加，即使在发达，食源性疾病也呈上升趋势，各国也越来越重视此项工作。近年来，人们采用免疫学、生物化学和分子生物学等先进技术进行快速检验方法的研究，使其发展更为迅速。传统的食源性病原微生物的检测、鉴定仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型等水平，存在操作烦琐、检测周期较长、检测结果往往存在不同程度滞后等缺点，这不仅不利于食品安全管理体系及时验证控制措施实施效果，也不利于对潜在不安全产品迅速采取纠正措施。对食源性致病菌进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为保证食品安全的迫切需求，从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向。上世纪50年代以来，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学（如ELISA及免疫层析试纸条法）为基础或以分子生物学法（如常规PCR及荧光定量PCR方法）为基础的快速检验方法，并在实践检验中不断取得新进展。ATP法、免疫法、和显色培养基法在国外应用相当成功，国内的许多检测机构也在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术，如纸片法、生物化学技术（如PCR技术和基因探针技术等）、选择鉴定用培养基法、免疫学技术、细菌直接计数法、全自动微生物分析系统（AMS）等。但这些方法中有些要求配备特殊的仪器，有些需要操作人员具有较高的技术水平，还有些财政和人力投入较大，因此绝大部分微生物快检方法在基层单位暂时无法推广应用。目前应用于微生物检测的常用方法及其优缺点见表1 .

上转发光技术

上转发光技术（up-converting phosphor technology,UPT）是基于上转发光材料（up-converting phosphor,UCP）而发展起来的一种新型标记技术，UCP是由几种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的纳米级颗粒。由于独特的结构，UCP可由红外光激发而发射可见光--上转发光（up-converting）。这种绝无仅有的性质使UCP作为标记物在生物分析中，以无本底干扰、无焠灭、适于多重分析和定量分析等具有显着优势，从本质上有别于传统标记物。因此一种叫做上转换发光颗粒免疫层析（UPT-LF）的检测技术应运而生，因其具有对样品种类的耐受程度高，不受操作环境、技术人员及设备的限制，操作过程简单快速的同时能够得到多重定量结果等诸多优点逐渐发展起来。

上转发光技术检测原理

UCP包括3种主要成分：主基质、吸收子和发射子，由于其独特的结构，可以出现反Stokes现象，即这种材料可在红外光区（波长>780nm）被激发，却发射波长远短于激发光的可见光（波长为475~670nm），这一现象在自然界中并不存在，其基本原理是双光子或多光子荧光，即能量上转。选择不同的吸收子、发射子和主基质可使UCP具有不同的光学性质，成为其使用灵活的基础。

上转发光技术与经典的免疫层析技术相结合，采用新型标记物--UCP上转发光材料，通过扫描分析光电信号，实现对目标抗原或抗体的现场快速检测。上转发光技术试纸条是由UPT与免疫层析共同组成，主要由试纸条以下5个部分组成：样品垫、结合垫又称结合物稀释垫、分析膜、吸水垫、粘性底衬。叠合顺序如图1所示，通过粘胶固定于粘性底衬上。

各部分的作用分别为：样品垫是滴加被检样品的部位；结合垫中含有标记物-生物活性分子结合物，在加入被检样品后，其可在试纸条上发生免疫反应；分析膜是免疫反应发生的部位，因此是层析试纸的核心结构，抗原、抗体等生物活性分子均固定其上作为检测带和质控带；吸水垫的虹吸作用为整个反应过程中的液流提供动力。为保证液体在试纸条上流动的连续性，各个部分之间需要有一定的重叠区。

检测时，首先将待检样品滴加到样品垫上，样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫，使其中固定的标记物--生物活性分子结合物重新解离，并在吸水垫的虹吸作用下，离开结合垫流入分析膜，向吸水垫的方向流动。此过程中标记物--生物活性分子结合物、目标被检物与检测带、质控带之间将发生一定的特异性免疫反应，并通过具有指示性的标记物产生反应信号。依据所发生的免疫反应方式的不同，可分为夹心模式与竞争模式。

上转发光技术发展的历程

UCP作为生物标记物所具有的独特优势在1995年便已引起了美国军方的重视，在国防部下属DARPA（Defense Advanced Research Projects Agency）的大力支持之下，开发了基于上转换发光技术的手持式传感器以及流式细胞仪（如图2），用于对战场上可能使用的多种生物战剂进行快速的预警与鉴定。

国内得益于我国稀土资源丰富，研究单位包括军事医学科学院微生物流行病研究所杨瑞馥实验室、北京热景生物技术公司，在2000年已经完成了UCP颗粒的制备，而且在颗粒上有了一定的突破；2002年创造了以UCP为基础的自主研制PCT;2003年，研制出了代UPT免疫分析仪；2005年研制出了第三代便携式系统，应用于安全、部队、疾控生物战剂检测，在生物应急领域，研制完成的UPT快速检测系统（UPT生物传感器及UPT免疫层析试纸）可检测鼠疫菌、炭疽芽孢、布鲁氏菌、抗鼠疫菌抗体、抗SARS-CoV抗体、霍乱O1菌、霍乱O139菌等多种病原体，已推广多个地方疾控系统--北京市卫生局、中国检验检疫科学研究院、防化研究院、鼠疫防治系统等职能单位；2008年，UPT系统已经实现了产业化；2011年获得国内个自主知识产权现场检测技术生产文号，并获得了完整的工艺流程与系统产品，已经开发出了面向临床、生物反恐、食品安全快速检测仪器及试剂，总共获得12个产品批准文号，该系列产品打破了国外技术的垄断，项目产品已经用于临床检测、军队和地方生物反恐、食源性致病菌检测等；2014年该项目获得中华医学会二等奖、北京市科技进步二等奖。

上转发光技术在微生物领域的应用

UCP独有的上转发光现象决定了它不存在背景干扰，Niedbala等（2001）报道了上转磷光技术已被应用于免疫标记分析，UCP作为标记物的免疫层析技术，它不仅克服了胶体金免疫层析只能定性而不能定量的缺陷，更以其适用于多重分析、无背景吸收、无焠灭等特点，赋予了免疫层析技术新的特性。2001年有学者报道，用上转换荧光横向流检测特定核酸氨基酸序列是一种快速，灵敏的检测DNA方法，可以识别人类乳头状瘤病毒16种类型的感染。Zuiderwijk M等（2003）报道了用双抗体夹心免疫层析法，在上转换荧光免疫技术和横向流动技术的基础上，可检测病原体链球菌，检测结果显示，只需要1ng DNA即可检测出肺炎链球菌，表明了UPT技术在传染病领域的应用潜力。Zhongqiang Y,Lei Z等在2006年研究开发了基于侧向流免疫上转换UPT技术的生物传感器，这种生物传感器已经被开发并用于快速定量检测鼠疫耶尔森氏菌，研究原理是用纳米级的UCP颗粒作为标记物，采用夹心免疫层析法，在UPT--LF免疫分析系统的平台上进行检测，从样品处理到数据结果分析不到30分钟。Vijaya等（2007），应用上转发光法快速检测呼吸道合胞病毒感染，此检测设备运用新型上转磷光技术，也是上转磷光技术次用于传染性疾病的检测，此设备设计便携，

可以直观的判定呼吸道合胞病毒（RSV）感染检测，此种方法的临床检测灵敏度为90%,特异性为98.3%,与经过RT-PCR验证的病毒培养相比较，相关系数达到96.2%.Corstjens等（2008），用UCP作为标记的层析流技术检测T细胞分泌的γ-干扰素，其分析灵敏度>2pg/mL.

上转发光技术在食品中病原微生物检测的应用

据WHO估计，由于全球性食品贸易的快速增长以及人口的流动，饮食习惯的改变，新食源性致病菌不断出现，全世界每年发生食源性疾病数10亿人，每年约有200万儿童死于腹泻，其中66%以上是由细菌性致病菌所致。

食源性致病菌导致的疾病是食品安全的关键问题，其中动物源性食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。UCP作为标记物的免疫层析技术，它不仅克服了胶体金免疫层析只能定性而不能定量的缺陷，更以它适用于多重分析、无背景吸收、无焠灭等特点，赋予了免疫层析技术新的特性。传统的横向流方法通常用有色颗粒标记，像胶体金或着色，通过颜色识别结果，然而，定性以及较低的灵敏度限制了其检测应用，而UCP颗粒在检测线下仍然可以检测，用基于横向流的上转发光技术分析，可以在109CFU/mL的微生物环境下检测到103CFU/mL的大肠杆菌O157:H7,浓度变异系数在0~107organism/mL之间均<10%,对于较小的微生物，检测线在5ng/mL以下。而且，此技术可以进行多重检测，可同时进行多靶标检测。研究发现，使用上转发光免疫层析试纸盒可对包括乙型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌O1、O139群、大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副溶血弧菌、伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌在内的10种食源性致病菌进行检测，不增菌检测敏感性为109~105CFU/mL,增菌敏感性<10CFU/mL.均可满足食物样本增菌检测和腹泻样本直接检测的灵敏度需求。线性拟合系数R2介于0.9~0.98之间，均具有良好的定量能力。每种试纸与其它9种菌之间无明显交叉反应，特异性良好。

上转发光技术在食品中病原微生物检测的应用前景

李斯特氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌等食品致病菌，已经成为威胁食品安全的头号杀手，快速而准确检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务，UCP作为标记物的免疫层析技术，它不仅克服了胶体金免疫层析只能定性而不能定量的缺陷，更以它适用于多重分析、无背景吸收、无焠灭等特点，确保了在检测过程中高度的敏感性、稳定性、安全性，赋予了免疫层析技术新的特性。同时上转发光技术的UCP颗粒因其具有对样品种类的耐受程度高，不受操作环境、技术人员及设备的限制，操作过程简单快速的同时能够得到多重定量结果等诸多优点逐渐发展起来，可以广泛应用于国内基层单位对食源性致病菌现场快速检测及诊断。随着对UCP研究的不断深入，上转发光技术在食品中病原微生物检测的经济价值、产业需求以及发展前景将不可限量。