β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

β-半乳糖苷酶的研究进展

β-半乳糖苷酶来源及作用机理。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）普遍存在于动物（幼小动物的肠中）、植物（杏、苹果等）及微生物（细菌、霉菌等）中，能够将乳糖水解为葡萄糖及半乳糖供生物体代谢使用。在生物体体内，β-半乳糖苷酶是由LacZ 基因编码翻译而成的蛋白质酶类，通过提取动物、植物及微生物中的乳糖酶蛋白，发现来自于不同物种体内的蛋白同源性较高，进而对乳糖酶基因进行深入分类研究，并建立了β-半乳糖苷酶基因库，其中大部分基因均来自于细菌 [1].在现今的乳糖酶应用过程中，主要利用也是微生物中提取得到的乳糖酶，其中尤以来自于酵母的乳糖酶类应用最广，如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克鲁维酵母（ Kluyveromyces fragilis ）、黑曲霉（Aspergillus niger）等。

乳糖酶能催化发生水解反应，转半乳糖苷反应及合成低聚半乳糖反应。催化机制主要取决于酶受体种类，当受体是水时，则发生水解反应，受体是糖或醇时，乳糖酶与受体发生转半乳糖反应，当作用于乳糖时，则催化合成低聚半乳糖。经研究发现，乳糖酶发生催化机制主要是因为乳糖酶上存在Cys 的巯基和 His 的咪唑基，这两者不仅可以使半乳糖苷的氧原子质子化，也通过作用于半乳糖分子首位碳原子，形成中间物，从而进一步对乳糖水解。

β-半乳糖苷酶的应用。19世纪末，由Beijerincek发现并报道β-半乳糖苷酶能水解乳糖，乳糖酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。

在食品上的应用主要为：⑴世界上超过一半的成年人因缺乏乳糖酶不能降解乳制品中的乳糖而出现乳糖不耐受，在我国这种现象更加普遍。乳糖酶的利用能水解乳制品中70%~80%乳糖，从而解决了乳糖不耐受患者的乳制品食用问题。⑵乳糖的甜度较低，不及蔗糖甜度的一半，但经乳糖酶水解后，生成的葡萄糖及半乳糖能很大程度的提高甜度，增加乳制品的适口性。⑶乳制品中的乳糖在温度极低时，易结晶，不利于乳制品的保存，经加入乳糖水解乳可在一定程度上解决结晶的问题。⑷较普通脱脂乳，乳糖水解乳可减少酸乳凝固时间，在酸奶的制作中，省时省力，且增加酸奶口味。⑸乳糖酶将乳清中的乳清蛋白水解，不仅可以减少废物排放，避免污染环境，乳清水解物还可制作糖浆、无害添加剂等，避免资源的浪费。⑹乳糖酶催化牛乳或乳清中的乳糖合成甜度较高、耐高温、耐酸的低聚半乳糖。目前，国内外学者对乳糖酶催化合成低聚半乳糖的研究较多。

低聚半乳糖的研究进展。低聚半乳糖性质及功能。低聚半乳糖（low oligosaccharide）的水溶性好，适口性好，甜度为蔗糖的20%-40%,有较好的保湿性。经热稳定性试验及恒温加速试验结果可知，当低聚半乳糖处于中性环境中，在100℃保存可1h,在120℃中可保存30min,当处于pH小于7环境中，稳定性较好，所以当低聚半乳糖在进入人体消化道后，良好的稳定性，有利于双歧杆菌的增殖，继而保障了人体的发育及提高免疫力。对人体健康主要从以下几方面体现：⑴利于有益菌的增殖，平衡肠道菌群；⑵促进有机酸的生成，调节肠道酸碱度，防止便秘；⑶通过被肠道微生物发酵，促进脂肪代谢；⑷促进人体钙的吸收，预防骨质疏松。

低聚半乳糖的应用。根据低聚半乳糖的理化性质及功能，在食品原料中，低聚半乳糖添加入焙烤食品，既不会造成营养成分的损失，也能增加食品风味。在乳制品中添加低聚半乳糖，则可以降低乳糖含量，增加甜度。用于糖果加工、饮料加工等。

β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究进展。低聚半乳糖的合成主要是通过方法简单且产量大的酶法合成制得，反应中的糖苷酶不仅可以催化水解糖苷键且能利用单糖等合成新的糖苷键。其中一部分糖苷酶对乳糖保持较高水解活性，能破坏底物的 β- 1 ,4 糖苷键并具有转半乳糖基作用，可以以底物及水解产物合成糖苷键，生成低聚半乳糖。

酶法合成途径。1 游离酶促反应，在水溶液环境中，通过游离酶完成低聚半乳糖的合成。据相关文献报道以质量分数为10%的乳糖为底物，以米曲霉乳糖酶为酶源，合成的低聚半乳糖收率可达70%以上，随着乳糖浓度的改变，收率也随之改变。通过利用细菌产生的酶与质量分数为30%的乳糖合成低聚半乳糖，收率为40%.相同质量分数的乳糖，利用双歧杆菌产生的酶与之反应合成的低聚半乳糖收率可达47.6%.

由此可见，游离酶促反应随着酶的来源不同，产物收率也不同。尽管在水溶液中反应具有方法简单、无污染的优点，但低聚半乳糖收率低，稳定性差且酶用量大，成本高的缺陷。

非水相酶反应，因水分过多会引起体系发生水解反应，使低聚半乳糖收率降低，所以该反应体系通过降低水含量，提高了低聚半乳糖收率。据相关文献报道通过利用含量为95%环已烷合成的低聚半乳糖收率比水溶液提高了7%.该反应体系使低聚半乳糖收率较高，但有机溶剂会影响乳糖酶活性，有机相与水相比例不当则会使乳糖酶活性明显下降。

固定化酶连续反应，该催化反应发生的过程是通过利用固定化酶，在CSTR或PFR的反应器中，生产低聚半乳糖。该反应体系的优点为利用的酶可以循环利用，生产的低聚半乳糖中不含利用的酶，纯度高，且在酸碱环境中稳定，耐高温，操作简单，缩短了生产时间。

固定化酶催化合成低聚糖的研究进展。由于固定化酶的分子结构稳固，热稳定性高；生成的低聚糖不易被酶降解等优势，使得该技术成为了研究热点。秦燕等通过利用凝胶包埋质量分数为40%的乳糖且在55℃、pH为5.5的条件下制得低聚半乳糖，收率达38%,虽然收率较游离酶技术提高不大，但连续反应使相同用量的酶的催化效率得到提高，合成的产物能够及时分离，极大降低了产物的抑制作用。王筱兰等固定米曲霉产生的β-半乳糖苷酶，在纤维床反应器中，以底物浓度400g/L,反应温度50℃，pH为6.0,停留时间40min,生产低聚半乳糖收率为40%.而在向反应物中加入D-半乳糖，可使低聚半乳糖收率从40%提高到60%.因为D-半乳糖是转半乳糖苷的底物之一，能够抑制水解反应的发生，从而促进了低聚半乳糖的合成反应，提高了收率。运用固定化酶促反应技术，不仅使低聚半乳糖的收率得到提高，而且酶的用量也逐渐降低，成本也得到了控制。同时随着从生产材料、固定化过程及生产环节的不断改进，生产成本还能得到更进一步的降低，具有广阔的发展前景。

总结

乳糖含量高限制了乳制品的消费，随着低聚半乳糖制品的开发，不仅可以解决乳糖不耐受问题，而且能改善食品的风味、质地、色泽等品质。因此，作为一种新型的功能性食品添加剂，对低聚半乳糖生产及应用仍需进一步深入研究，使其更符合人们生活需求。

作者简介：刘鑫龙（1988-），男，满族，河北承德人，助教，硕士，研究方向：生物工程；王立晖（1981-），男，副教授，硕士，研究方向：食品科学；汤卫华（1979-），女，副教授，博士，研究方向：发酵工程；殷海松（1980-），男，河北任丘人，讲师，硕士，研究方向：发酵工程；孙勇民（1963-），女，教授，硕士，研究方向：生物化工。

作者单位：天津现代职业技术学院