5种鲜切莲藕片胀袋微生物的分离与鉴定

摘要：真空包装鲜切藕片的胀袋问题影响了其产品质量，为了解决胀袋问题，研究了鲜切藕片胀袋主要微生物的种类，分离出 5 种优势微生物，并利用 VITEK 2 Compact 全自动快速微生物鉴定智能分析系统进行鉴定。得到了 2 株细菌分别为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae） 、蜡样芽孢杆菌（Bacilllus cereus Frankland& Frankland） ,3 株酵母菌，季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii） 、无名假丝酵母（Candida famate）和葡萄牙假丝酵母（Candida iusitaniae） .

关键词：胀袋藕片；分离；鉴定；VITEK 2 Compact 菌种鉴定系统

莲藕是我国栽培历史悠久的水生蔬菜， 因其迷人的白色、 甜脆的口感和丰富的营养已经成为各地的蔬菜之一。近年来，鲜切莲藕作为一种新型的微创处理蔬菜，以其方便、快捷、低碳、环保和安全洁净的特点深受广大顾客的喜爱 [1] .但是，鲜切莲藕的保质期一直是制约产业化的瓶颈，究其原因，鲜切莲藕在其加工过程中，细胞组织受损，易受微生物污染 [2] ,鲜切莲藕的高湿度和高营养促进微生物生长繁殖。因此，要想控制鲜切莲藕的微生物的生长繁殖，必须探究促使鲜切莲藕胀袋的微生物菌群，也进一步揭示那些在常规的真空包装贮藏过程中难以有效控制的微生物种群，从而为寻找新的保鲜措施奠定良好的基础。

国内外有较多关于肉制品中胀袋微生物分离鉴定的报道，如 Brightwell 等 [3] 从胀袋的真空包装羊肉中分离出的嗜冷肠杆菌；Silva 等 [4] 从胀袋的巴西真空包装牛肉中分离出的嗜冷梭状芽胞杆菌。刘常金等 [5] 从胀袋的烧鸡中分离出绿脓假单胞菌。徐世明等 [6] 从胀袋的烤鸡中分离生孢梭状杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌是等腐败菌。国内杨颖等 [7] 研究发现朗比克假丝酵母与藤黄微球菌是导致脆梅胀袋的主要微生物。但是对于引起鲜藕片胀袋的特定腐败微生物的研究鲜见报道。

目前，对于细菌和酵母菌的鉴定方法从传统的生化鉴定，分子生物学方法，API 和 VITEK 等智能鉴定系统，都实现了对菌种鉴定的高度准确率。而前两种方法操作复杂，费时，常采用一对一符合式鉴定模式，难以实现食品中快速检测的需求，而 VITEK 2 Compact 菌种鉴定系统不仅克服了传统菌种鉴定费时、操作要求高的缺点，而且也有较高的鉴定准确率和较好的集成性 [8] .乔宁等 [9] 利用该系统对 20 株常规细菌的鉴定符合率为 .

本研究旨在分离鉴定促使鲜切莲藕真空包装胀袋的微生物样本运用梅里埃 VITEK 2 Compact 菌种鉴定系统对所有的分离株进行鉴定，进而确定促使鲜切莲藕真空包装胀袋微生物种群。

1  材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验样品 “3735”莲藕 购于华中农业大学菜场。

1.1.2 培养基 用于细菌和真菌分离培养的培养基营养琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；MRS 培养基：蛋白胨 10.0g,牛肉浸膏 10.0g,酵母浸膏 5.0g,葡萄糖 20.0 g, 吐温 80 1.0 g,磷酸氢二钾 2.0 g,乙酸钠 5.0 g,柠檬酸三铵 2.0 g,水合硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）0.5 g,水合硫酸锰（MnSO 4 ·4H 2 O）0.05 g,蒸馏水 1 L,pH 6.0~6.5[ 10 ]

1.1.3 试剂 革兰氏染色液，美兰染色液，孔雀绿染色液，生理盐水，75%酒精

1.2 仪器与设备

VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统仪 配有革兰阴性菌、 需氧芽孢杆菌和酵母菌鉴定卡 法国生物梅里埃中国有限公司；DZ-500K 型真空（充气）包装机 上海申越包装机械制造有限公司；AR2140 型分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；SPX-250B 型生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；DEM 光学显微镜 上海徕卡显微系统有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鲜切藕片的制备

新鲜莲藕经清洗，切分（8mm）后进行真空包装（PA/PE 复合袋） ,每袋放置 6 片大小均一（直径 7cm-8cm）的藕片置于 37℃恒温箱内培养，收集胀袋样本以备后续分离。

1.3.2 胀袋微生物的分离与纯化

从胀袋的藕片包装中以无菌操作方法称取 25g, 加入盛有 225 mL 无菌生理盐水（0.85%）的三角瓶中， 振摇混匀， 再以无菌生理盐水依次进行 10 倍的梯度稀释 [11] . 取 10 -5 、 10 -6 、 10 -7 稀释液各 0.1ml分别涂布于 MRS、PDA、营养琼脂培养基平板上， （为抑制细菌的污染，先在 200mLPDA 培养基中加入 lmL100mg/mL 经过滤除菌的头抱霉素和 2-3 滴 25%的乳酸， 再倒平板） 分别于 37℃ （48h） 25 ℃（72h） ,37℃（24h）进行厌氧（烛缸法）和好氧培养。观察并记录主要胀袋菌的菌落特征，挑取优势单菌落分离纯化（划线 3 次以上） [12] ,接种到试管斜面于 4℃冰箱保存备用。

1.3.3 微生物反证实验

将分离纯化的菌株分别接种于斜面，用无菌生理盐水制备成 10 6 -10 7 CFU/mL 浓度的菌悬液，分别接种到已经灭菌的藕片（用 95%乙醇浸泡 3min,再用无菌水冲洗 4-5 次）然后进行真空包装封袋，放置于 37℃的培养箱 7 天，观察是否有胀袋现象。每个菌种做 3 个平行，没有接种的无菌藕片（用无菌水浸泡 5min）作为阴性对照。

1.3.3 镜检

细菌：取 1 环斜面培养物进行革兰氏染色 [10] ,观察个体形态和纯度。

酵母菌：（1）形态观察：生理盐水浸片法 [10] ;

（2）繁殖方式：美兰染色法 [13] ;

（3）假菌丝观察 [13-14] ;在培养皿中倒一薄层 PDA 培养基，凝固后倒置数小时使表面干燥并

活化 3 代后的菌株呈“Z”字形划线接种。25℃培养 1 天后，在新长出的少量菌体上轻轻覆盖灭菌盖

玻片并继续培养。培养 3-5 天后，用无菌镊子取下盖玻片放于划线两旁的缺氧区域是否形成假菌丝。

（4）子囊孢子观察 [10] ;孔雀绿芽孢染色法；

1.3.4 菌种鉴定

细菌和酵母菌鉴定均采用 VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统鉴定。

2 结果与分析

2.1 胀袋微生物的分离纯化及菌种返接藕片的腐败性观察

真空包装的鲜切藕片在 37℃贮藏 2 天出现严重的胀袋情况，在第二天进行分离，采用平板计数法，结果在 10 -7 稀释液涂布的平板上三种培养基上均有菌落产生。其中在 NA 培养基上有 8 个典型菌株，在 MRS 培养基上有 3 个典型菌株，在 PDA 培养基上有 7 个典型菌株。分别以 N1-N8,L1-L3和 Y1-Y7 表示，采用平板划线法进一步分离纯化，进行反证实验，结果见表 1.

由表 1 可知：接种后的藕片贮藏 7 天后，所有接种的藕片都出现了酸味，也有不同程度的软化，表示分离的这几种菌都有不同程度的致腐作用；N2、N6、Y1、Y3、Y4 都出现了严重胀袋现象（3 个平行都胀袋），打开包装袋可以闻到强烈的酸味，也有不同程度的软化。而其它接种的藕片和对照藕片放置 7d 后仍然保持真空包装的状态，因此可以断定 N2、N6、Y1、Y3、Y4 是引起藕片胀袋的主要菌株。

2.2 菌株的形态特征及腐败菌的鉴定

经过反证实验后，N2、N6、Y1、Y3、Y4,这 5 个菌株的菌落形态特征和细胞形态特征见表 2,5 个菌株的显微形态见图 1.

综合形态特性与生理生化特性，根据伯杰氏菌种鉴定手册[ 15 ] 和酵母菌的特征与鉴定手册 [ 14 ] ,结合 VITEK 2 Compact 的鉴定结果，进一步确定这 5 种菌分别为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae） 、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） 、季也蒙假丝酵母（ C. guilliermondii ） 、无名假丝酵母（C. famate）和葡萄牙假丝酵母（C. iusitaniae） .

真空包装鲜切果蔬制品目前已经很普遍，因为微生物污染，在贮藏期间，鲜切果蔬会出现腐败和胀袋是两个比较严重的问题，而很多研究也只针对于腐败问题对其致腐微生物进行分离及鉴定。如赵国娇 [16] 等对真空包装的鲜切紫薯的菌相进行研究，发现整个贮藏过程中酵母菌数量优势明显；方兰兰[17] 等对真空包装鲜切莲藕中微生物进行分析，通过不同选择性的细菌培养基分离出 7 种细菌。本文

真空包装鲜切藕片胀袋微生物的分离与鉴定作为探讨真空包装鲜切果蔬胀袋问题的依据，将为抑菌并延长真空包装鲜切藕片保质期提供参考。

3 讨论

本文以胀袋的真空包装鲜切藕片为材料进行平板划线分离纯化，得到8株细菌，3株乳酸菌和 7株酵母菌。为了验证这 18 株微生物是否为藕片的胀袋微生物，对其进行了反证实验，结果表明：2 株细菌、3 株酵母菌可以造成藕片的胀袋。细菌和酵母菌在 2d 内可以有一定程度的胀袋，7d 达到了严重的胀袋还伴有酸臭味。

对反证实验的菌株进行鉴定，发现 2 株细菌分别为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae） 、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）， 3 株酵母菌都属于假丝酵母属（Candida） .阴沟肠杆菌广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，是肠道正常菌种之一，为条件致病菌。该菌能利用大多数碳水化合物在 37℃发酵产气，甘油或肌醇发酵不产气

[ 15 ] .蜡状芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌分布很广，土壤、空气等均有分布，在植物性食品和许多生熟食品中也常见，可致食物腐败和引起中毒

[ 18 ] .对葡萄糖发酵的主要产物包括 2,3-丁二醇、乙酰基甲基甲醇、甘油、乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸和 CO 2 ,产物因培养条件而不同

[ 15 ] .分离的三种酵母季也蒙假丝酵母，无名假丝酵母和葡萄牙假丝酵母都属于假丝酵母属，耐高渗透压，许多种可发酵葡萄糖和其他糖类，能够将糖转化为酒精和 CO 2

[ 19 ] .这与刘翠云 [20] 在气调包装的莲藕中分离出引起胀袋的酵母菌有一定的一致性。在真空包装的肉禽产品中，芽孢杆菌、 肠细菌和假丝酵母属都是常检出微生物

[ 21 ] . 如高鹏等 [22] 研究出芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属细菌的存在可能是引起真空包装肘花胀袋从而使产品变质的主要原因； 黄玲等

[ 23 ] 从胀袋番茄酱中分离出季也蒙假丝酵母；王向阳

[ 24 ] 等从胀袋腌萝卜干中分离出了蜡样芽孢杆菌；王宏勋 [ 25 ] 等以真空包装土豆研究了真空包装净菜的菌相组成，表明酵母菌是净菜初始微生物中数量占优势的一种优势菌。虽然肉制品、酱制品和腌制品与鲜切果蔬加工工艺不尽相同，但由于其营养成分的相似都给微生物提供了适宜生长的环境，也导致了这些微生物代谢产生气体最终导致胀袋。这验证了这 5 种菌确实有导致胀袋的情况发生。

真空包装的鲜切藕片的制作经历了莲藕采摘、贮藏、清洗、去皮、切片、包装这几个步骤，为了减少人为增加的微生物污染，莲藕在去皮、切片、包装整个过程都是采用无菌操作，因此，可推断，水源和莲藕自带的微生物是导致真空包装鲜切藕片胀袋的根源，又由于莲藕中含有水分、蛋白质、糖分以及少量的维生素和其他有机物，在适宜的温度贮藏下为细菌和酵母菌的生长创造了有利条件。本文通过分析鲜切藕片的胀袋微生物，为下一步进行胀袋微生物的溯源提供了依据，有助于寻找确切的污染源头，在贮藏过程中加以重点控制，加强产品品质提供保障。

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