采用GC/MS方法检测苹果汁和苹果酒中的天然棒曲霉素

□ Pat Sasso 安捷伦科技有限公司

随着苹果生长期的延长以及苹果和苹果浓缩汁出口能力的提高，它们摄入污染产品的可能性也随之增加。棒曲霉素是一种真菌霉素，在苹果腐烂过程中产生。本文描述了一种采用安捷伦超高惰性色谱柱检测棒曲霉素的方法，该方法无需样品衍生化。该色谱分析方法可以分离5-羟甲级糠醛（HMF），它是一种由苹果产品中的糖在过度加热时生成的产物。使用聚苯乙烯-二乙烯苯SPE柱执行固相萃取，然后在注入GC/MS系统检测前用乙酸乙酯进行液/液萃取，完成样品制备。

苹果酒和苹果汁是全球十大消费量的水果饮料之一。苹果以及苹果产品的三大生产国分别是中国、美国和波兰。这三个苹果产区的气候条件非常适合多种苹果的生长。市售苹果汁经由过滤、巴氏消毒以及真空包装等工序加工而成，口味独特、气味芳香、保质期长。棒曲霉素来源于青霉素霉菌，包装产品要求尽量避免棒曲霉素的产生，其含量被控制在10ng/g以内。在果汁生产过程中对棒曲霉素的检测方法有很多，包括HPLC/UV方法、GC方法以及GC/MS方法，这些方法有些需要衍生，有些无需衍生。尽管这些方法都经济可靠，但如何分离棒曲霉素与HMF对于反相HPLC方法来说还是一个难题。不过，可以通过LC/MS/MS方法来验证两者是否成功分离。在鲜苹果汁的生产过程中，因为加工步骤的关系，果汁中会含有果胶，果胶能够降低血清胆固醇从而增加果汁的健康价值。然而，这种简化的加工方法增加了缩短保质期的风险，棒曲霉素产生的可能性也将显着提高。

材料与方法

将Agilent 7890A GC与配备有惰性EI 350℃无涂层离子源的Agilent 5975C质谱仪联用。Agilent J&W DB-35ms UI色谱柱安装在多模式进样口（MMI）上，采用冷-不分流模式以获取样品传输。棒曲霉素以及HMF购自Sigma-Aldrich公司，浓度为100μg/mL（棒曲霉素）或纯品（HMF）。

分析条件

标样

将乙酸乙酯作为溶剂，配置浓度范围10~1000ng/g的棒曲霉素和HMF混合标准溶液，用于测定线性和检测限。将购买的苹果汁和苹果酒冷藏保存。在初步筛选后，使用空白提取物做稀释溶剂来制备与样品基质相匹配的校准组。

样品制备

1.称取10g（10mL）的苹果汁或苹果酒置于洁净的容器中。

2.向样品中添加10ng/g（10ppb）的标样用以测定标样在果汁中的回收率。

3.依次用4mL甲醇、4mL HPLC级的去离子水平衡SPE管。

4.向经过预平衡的SPE柱加10mL样品，让样品自然流出（根据样品的澄清度，苹果酒可能需要稍微抽一下真空）。

5.在常压下用8mL 1%的碳酸氢钠水溶液淋洗柱子。

6.在常压下用8mL 1%的醋酸水溶液淋洗柱子。

7.用收集管替换废液管。

8.在常压下用8mL HPLC级的甲醇进行洗脱。

9.用温水浴干燥洗脱液来除去甲醇，干燥至余下大约4mL的水溶液。

10.用3mL乙酸乙酯对洗脱液进行液/液萃取（3次），合并萃取液并收集于锥形管中待干燥。

11.将乙酸乙酯萃取液干燥至1mL,转移至自动进样瓶中待进样。

结果与讨论

图1是10ng/g HMF与棒曲霉素混合物的全扫描色谱图。峰形理想、基质背景干扰少。

加标样品的回收率大于90%,说明Bond Elut LMS SPE可用于低浓度样品的分离。萃取步骤将会去除果汁中所含有的10%的糖类物质，因为它们会在短时间内污染进样器，使得进样口的维护频率增加。被去除的还有大量维生素C,因为它会与HMF一起洗脱出来，干扰色谱峰的积分。一些高沸点的溶质，如，多酚类物质会被一同萃取出来。这些高沸点物质会在进样口积聚，在允许温度下烘烤一段时间可被去除。本方法可以分离苯甲醛，它是一种苹果种子腐烂时会产生的一种标志性化合物。尽管拖尾比较多，MMI模式下的峰对称性仍可与冷柱头进样模式下的峰对称性相媲美。

结论

在使用Bond Elut LMS萃取柱以及液/液萃取制备样品之后，Agilent J&W DB-35ms超高惰性色谱柱可以很好地分离棒曲霉素和羟甲基糠醛。如果样品量很大，进一步的优化和自动化萃取步骤可以节省大量时间。